A Columbia Pictures stúdiónál belsőépítészként dolgozó apa és amatőr színésznő anya orvosnak szánta Dustint. Az ifjú Hoffman tanulmányi eredményei azonban közel sem voltak fényesek, a színpad is jobban érdekelte, így egy év után kimaradt az egyetemről. Beiratkozott egy színiiskolába, ahol szobatársa Gene Hackman volt, de két év után mindkettejüket eltanácsolták, mondván, hogy tehetségtelenek. A két barát New Yorkba buszozott, ahol alkalmi munkákból tartották el magukat, miközben színikurzusokra és meghallgatásokra jártak. Hoffmant a siker kitartóan elkerülte, apró reklámoknál többre nem kérték fel.
A kitartás azonban meghozta gyümölcsét, 1964-ben már egy egész sor Broadway-darabban szerepelt. Pályafutása innentől olyan, akár az amerikai álom, annak ellenére, hogy korántsem filmsztáralkat, hiszen alacsony termetű, vékony testalkatú és fellépése sem magabiztos. 1967-ben őt választották ki a Diploma előtt című film főszerepére, s bár ekkor már elmúlt harmincéves, meggyőzően alakította az életben helyét kereső egyetemistát, jutalma Oscar-jelölés lett. 1969-ben az Éjféli cowboy halálos beteg, magányos csirkefogójáért már másodszor jelölték az Oscar-díjra. 1970-ben játszotta el a Kis nagy ember főszerepét, amivel bekerült a Guinness-rekordok könyvébe is, hiszen a főszereplőt 17 éves tinédzserként és 121 éves aggastyánként is életre keltette.
Dustin Hoffman 1973-ban a Pillangó, 1974-ben a Lenny főszerepét játszotta el, utóbbiért hét év alatt harmadszor jelölték a filmvilág legrangosabb kitüntetésére. 1976-ban két emlékezetes filmet is forgatott: a Maraton életre-halálra című thrillerben Sir Laurence Olivier volt a partnere, Az elnök embereiben a Nixon elnököt megbuktató, a Watergate-botrányt felderítő két újságíró egyikét játszotta. 1979-ben nem állt rá könnyen, hogy eljátssza az elvált apa szerepét a Kramer kontra Kramerben, s amikor igent mondott, kikötötte, hogy improvizálhat, sőt a vágásba is beleszólhat. A film ezért-e vagy sem, de tarolt az 1980-as Oscar-gálán, öt díja közül az egyik Hoffmannak jutott a legjobb férfi főszereplő kategóriában.
Az 1982-es Aranyoskámban női ruhába bújt, igencsak próbára téve a rekeszizmokat, s alakításáért ismét Oscar-díjra jelölték. 1987-ben pályafutása leglátványosabb kudarcának bizonyult a Warren Beatty rendezte Istar, a csorbát a következő évben az Esőember autista főszereplőjének megformálásával köszörülte ki. A nagy stúdiók kezdetben húzódoztak az „ostobácska” történettől, a forgatókönyvet végül a United Artists vállalta fel. A producerek nem jártak rosszul: a film nemcsak kasszasiker lett, de sorra nyerte a díjakat, maga Hoffman pedig – aki a szerepre készülve heteket töltött autisták között – megkapta második Oscar-díját.
A színész ezután változó sikerű és színvonalú filmekben állt kamera elé, 1990-ben a Dick Tracy, 1991-ben a Hook, 1995-ben a Vírus, 1997-ben az Őrült város főszerepét játszotta. Ugyanebben az évben az Amikor a farok csóválja című filmért hetedszer jelölték Oscar-díjra. Az új évezredben az Én, Pán Péter, A parfüm: egy gyilkos története, a Vejedre ütök című filmekben láthattuk – utóbbi vígjátéknak két éve folytatása is készült. 2008-ban emlékezetes alakítást nyújtott Emma Thompson társaságában a Szerelem második látásra című drámában. Tavaly az HBO Befutó (Luck) című sorozatában vállalt főszerepet, de az egyébként nagy sikerű sorozatot a csatorna leállította, mert a forgatáson három ló is elpusztult. Hoffman rendez is, Londonban forgatja a Nagy négyes című komédiát, amely egy operaénekeseknek és zenészeknek létrehozott idősotthonban játszódik.
Dustin Hoffman egyedülálló módon három olyan filmben is főszerepet játszott, amely elnyerte a legjobb filmnek járó Oscar-díjat (Éjféli cowboy, Kramer kontra Kramer, Esőember), ötször kapta meg a Golden Globe-díjat, van Emmy-díja is, 2009-ben pedig a francia Művészet és Irodalom Lovagrendjének tagjává avatták. A kitüntetés hallatán elsírta magát, erről később azt mondta: „az én koromban már az időjárás-jelentésen is elsírja magát az ember”.
A színésznek két házasságából hat gyermeke van, s immár kétszeres nagyapa is, politikai nézeteit tekintve a demokraták lelkes támogatója.
