1845. március 27-én született Lennepben, Düsseldorf közelében; apja posztókészítő és -kereskedő volt. A család nem sokkal később Hollandiába költözött, így Röntgen Utrechtben kezdte műszaki tanulmányait, de az iskolából kicsapták, mert nem volt hajlandó elárulni egy osztálytársát, aki tanárukról karikatúrát készített. Végül a zürichi műegyetemen szerzett gépészmérnöki oklevelet 1868-ban, ezután August Adolph Kundtnak, a kor ismert fizikusának az asszisztense lett. 1873-ban Strasbourgban egyetemi magántanár, majd rendkívüli tanár lett, 1879-ben a Giesseni Egyetem fizikaprofesszorává nevezték ki. 1888-ban a würzburgi egyetemen kapott tanszéket, 1900 és 1920 között Münchenben vezette a fizikai intézetet.
Röntgen 1895. november 9-ére virradóra írta be magát örökre a tudomány történetébe. Ezen a napon katódsugárcsővel kísérletezett, ebben a majdnem légüresre szivattyúzott belsejű hengerben a katódból fókuszált elektronsugarakat lehet „előcsalogatni”, amelyek a feszültségtől függő sebességgel lefutnak a csövön. Röntgen homorú tükörformájú katódot használt, hogy az elektronnyalábot a szemközti csőfal minél kisebb felületére koncentrálhassa. A sötét szobában arra lett figyelmes, hogy a cső közelében egy sugárzásra érzékeny anyaggal bevont ernyő zöldes fénnyel kezdett világítani. Mivel a fekete papírba burkolt cső falán sem a katódsugár, sem a látható fény nem tud áthatolni, a jelenséget csak egy ismeretlen sugárzás okozhatta. Még nagyobb csodálkozására a sugárzás akkor is csak kicsit gyengült, amikor könyvet tett a cső és a képernyő közé, sőt ernyőt tartó ujjainak csontjai is kirajzolódtak a képernyőn, ami azt bizonyította, hogy a láthatatlan sugár a kézen is áthatol.
Az X-sugárnak elnevezett új sugárzásról a következő napokban az is kiderült, hogy a vastag ólomlemezen kívül szinte minden anyagon áthatol, ráadásul nemcsak a fluoreszkáló képernyőn, hanem a fényképlemezen is nyomot hagy. (Ma már tudjuk, hogy a röntgensugárzás – amelyet angolszász nyelvterületen máig X-sugaraknak neveznek – az elektromágneses sugárzás egy formája, amelynek hullámhossza 10 nanométer és 100 pikométer közé esik, és ionizáló hatása van.)
Felfedezését Röntgen egy hónap múlva publikálta, újabb egy hónappal később, 1896. január 10-én pedig a francia akadémián ismertették, ahol egy emberi kéz és egy béka átvilágított képét is bemutatták. Röntgen felfedezéséért 1901-ben elsőként kapta meg a fizikai Nobel-díjat. A sugarat kezdetben a csonttörések és idegen testek felkutatásánál használták, de gyorsan elterjedt a műtéti beavatkozásoknál is, első alkalommal James Adams glasgow-i sebész operált 1897-ben ily módon vesekövet. Hamarosan kiderült, hogy az emberi test sugárelnyelése alapján négy fokozatot lehet megkülönböztetni: a csontok elnyelése a legnagyobb, így ezek árnyéka a legélesebb, a második a bélrendszer, ahol a víztartalom a meghatározó, ezt követik az izmok, illetve a bennük levő zsírtartalom, a legkevesebb sugárzást a tüdő nyeli el a benne levő levegő miatt.
Röntgen azt feltételezte, hogy az X-sugarak a fényhez hasonló természetűek, mivel a mágneses tér nem térítette ki őket útjukból. Évekig kísérletezett hiába, hogy a fénytörés és a visszaverődés jelenségét kimutassa rajtuk, a diffrakciót végül 1912-ben a szintén Münchenben tanító Max von Laue elméleti feltételezése alapján munkatársai, Friedrich és Knipping mutatták ki kristályrács segítségével. (Ezért Laue kapott Nobel-díjat, 1914-ben. Fél évszázaddal később a röntgensugárral kapcsolatban ismét Nobel-díjat ítéltek oda Allan M. Cormacknek és Godfrey Newbold Hounsfieldnek, akik kidolgozták a komputertomográf matematikai modelljét, ez teszi lehetővé rétegfelvételek készítését, mintegy metszetekben vizsgálva az emberi szervezetet.)
Strasbourgi évei alatt Röntgen a gázok fajhőjét tanulmányozta, Giessenben és Würzburgban az összenyomhatóságra, a belső súrlódásra és a felületi feszültségre vonatkozó írásai jelentek meg. A tudós 1920-ban vonult nyugdíjba és 1923. február 10-én halt meg. A szigetelők elektromos térben való mozgatásakor keletkező röntgenáram is az ő nevét viseli, miként a 111-es rendszerszámú elem, a roentgenium is.
